Las dos técnicas amplifican una región específica de ácido nucleico mediante ciclos de temperatura. La diferencia está en cuándo se mira el resultado, y de ahí se desprende todo lo demás: qué información se obtiene, cuánto trabajo posterior hace falta y qué equipo se necesita.
La PCR convencional mira al final. La PCR en tiempo real, o qPCR, mira en cada ciclo.
PCR convencional: el resultado se lee al terminar
En una PCR convencional el termociclador ejecuta la serie de ciclos de temperatura y, al terminar, entrega un tubo con producto amplificado. Para saber qué hay dentro hay que analizarlo aparte, habitualmente por electroforesis en gel, donde se observa si apareció una banda y de qué tamaño.
Es lo que se llama detección de punto final. Responde bien a la pregunta de si el fragmento está o no está, y permite estimar su tamaño, pero no dice cuánto material había al principio: al final de la reacción los reactivos se agotan y muestras que partieron con cantidades muy distintas pueden terminar con bandas parecidas.
Sigue siendo la técnica adecuada para clonaje, verificación de construcciones, tamizajes y genotipado por tamaño de fragmento, donde la pregunta es cualitativa.
qPCR: el resultado se construye durante la reacción
La PCR en tiempo real incorpora una química fluorescente cuya señal aumenta a medida que se genera producto, y un sistema óptico que la mide ciclo a ciclo. El resultado no es una banda al final, sino una curva de amplificación.
De esa curva se obtiene el dato que da nombre a la técnica: el ciclo en que la señal supera el umbral de detección. Ese número se relaciona con la cantidad de material de partida, de modo que la respuesta deja de ser si está o no está, y pasa a ser cuánto hay.
Hay una ventaja operativa que suele pesar tanto como la cuantificación: la reacción no se vuelve a abrir. Al no haber manipulación posterior a la amplificación, se elimina la principal fuente de contaminación por amplicón en un laboratorio de biología molecular, que es el producto de la corrida anterior circulando por la sala.
Una aclaración necesaria: RT-PCR no es lo mismo que PCR en tiempo real
Es una confusión frecuente y vale la pena dejarla resuelta, porque las siglas se parecen y significan cosas distintas.
RT-PCR es retrotranscripción seguida de PCR. Se usa cuando el material de partida es ARN: primero se convierte a ADN complementario y luego se amplifica. La sigla RT viene de la transcripción reversa, no de tiempo real.
PCR en tiempo real, o qPCR, se refiere a la detección durante la reacción. Las dos cosas se combinan con frecuencia, y de ahí sale la RT-qPCR, que es retrotranscripción seguida de PCR en tiempo real. Es el formato habitual en detección de virus de genoma ARN y en estudios de expresión génica.
Qué información entrega cada una
- PCR convencional: presencia o ausencia del fragmento y su tamaño aproximado. Información cualitativa.
- qPCR: cuantificación relativa o absoluta del material de partida, además de la presencia. Información cuantitativa.
- qPCR con múltiples canales: varios blancos detectados en la misma reacción, lo que se conoce como multiplexado.
Esa última capacidad es la que más cambia el rendimiento diario. Detectar varios blancos en un mismo pocillo, incluido un control interno, ahorra reactivo, tiempo y muestra.
Qué equipo requiere cada una
Un termociclador convencional solo necesita controlar temperatura con precisión y uniformidad en todo el bloque. Un sistema de PCR en tiempo real necesita además un sistema óptico capaz de excitar y leer fluorescencia en varios canales, y el software que convierte esas lecturas en curvas y resultados.
Los equipos de la categoría de termocicladores del catálogo son sistemas de PCR en tiempo real de la línea Tianlong Gentier, en formatos de 48 y de 96 pocillos y con múltiples canales de fluorescencia, más un modelo portátil para trabajo en terreno.
Cuál corresponde a tu laboratorio
La pregunta se ordena por lo que se necesita responder:
- Si basta con saber si el fragmento está presente, la PCR convencional resuelve con menos inversión.
- Si hace falta cuantificar, la qPCR es el camino y no hay atajo.
- Si el laboratorio hace diagnóstico molecular, la detección en tiempo real es el estándar de trabajo por sensibilidad, por trazabilidad del dato y por el menor riesgo de contaminación.
- Si se procesan varios blancos por muestra, el multiplexado cambia el costo por resultado.
Los criterios de selección del equipo, una vez decidida la técnica, están en cómo elegir un termociclador.
La técnica se elige por la pregunta que hay que responder
¿Estás evaluando implementar PCR en tiempo real en tu laboratorio? La configuración adecuada depende del tipo de ensayo, del volumen de muestras y del nivel de multiplexado que necesites. En Zebra Genetics revisamos contigo esos requerimientos y las alternativas de la categoría de termocicladores antes de cotizar: cuéntanos tu aplicación.
Nota: este artículo tiene fines informativos y describe las técnicas en términos generales. Las especificaciones de cada equipo, incluidos canales de fluorescencia, capacidad y desempeño, deben verificarse en su ficha técnica oficial.
